• SERVICE
  • DNA Sequencing

DNASequencing

  • 소개
  • 서비스 종류
  • 서비스 가격
  • Universal Primer list
  • Vector Binding Primer
  • Troubleshooting

소 개

  • 코스모진텍 Sequencing service는 High throughput DNA Analyzer를 이용하여
    빠르고 정확한 서비스를 제공합니다.
    • - 샘플 접수 후 24시간 이내 결과 발송 및 SMS 알림 서비스
    • - 다양한 범용 universal primer 무료 제공
    • - Sequencing Primer 합성 서비스와 연계하여 신속한 결과 제공
    • - Long capillary (50 cm)를 사용하여 길고 정확한 결과 제공
    • - 자사 제품 및 서비스와 연계된 다양한 부가 서비스 제공

Regular Sequencing

  • Normal Sequencing
  • Difficult Sequencing
  • Additional Services
  • 일반적인 sequencing 서비스로 plasmid나 PCR product를 지정하신 primer를 이용하여 염기서열 분석을 수행합니다.

샘플 준비

    • Template
    • - Plasmid : Concentration 150-200 ng/㎕, Volume 10㎕
    • - PCR product (purified) : Concentration 50 ng/㎕, Volume 10㎕
    • - PCR product (non-purified) : Concentration 50 ng/㎕, Volume 20㎕
    • Primer
    • - Concentration : 5 pmole/㎕ , Volume : 5㎕
    • - Tm : 55~60℃, GC content : 40~60%
  • 샘플의 염기서열 특이성으로 인해 normal sequencing 결과에서 분석저해 양상을 보이는 경우 본 서비스로 성공률을 높힐 수 있습니다.
    • - 염기 서열 특정부위에서 GC-rich, Secondary structure 및 반복서열 등으로 인해 분석저해 양상을 보이는 샘플에 적용됩니다.
    • - 샘플의 특이성에 따라 분석저해 양상이 해소되지 않을 수도 있으며, 분석저해의 양상이 완전히 해소되지 않아 broad한 peak 양상이 나타날 수도 있습니다.

Custom PCR

    • Targeted sequencing하고자 하실때 제공해 주시거나 또는 당사 PCR optimization service를 통하여 제작된 primer를 사용하여 PCR을 진행해 드리는 서비스입니다.

PCR purification

    • PCR product는 sequencing 반응에 영향을 미칠 수 있는 잔류 dNTPs와 primer를 반드시 제거해주어야 합니다. 당사에서는 enzymatic method (Exo/SAP) 또는 column method로 PCR product cleanup을 진행해 드립니다.

Gel extraction

    • PCR product의 nonspecific product가 눈에 띄게 심한 경우 agarose gel 전기영동을 통하여 specific band를 정제해 드립니다.

Plasmid miniprep

    • Transformed E.coli 상태로 의뢰시 배양 후 plasmid miniprep을 진행해 드립니다.

BigDye pre-reacted sample running

    • 직접 sequencing 반응을 진행하셔서 당사에 running만을 의뢰하실 경우, 당사에서는 이후 단계부터 진행해 드립니다.
    • [의뢰시 유의사항]
    • - Kit version : BigDye Terminator version 3.1
    • - 당사 Sequencing running condition : 장비, ABI3730xl; Polymer, POP7; capillary 50 cm
    • - Sequencing 반응단계에서 문제가 있을 경우 당사는 그 결과를 책임지지 않습니다.

Special Sequencing

  • Microbial Identification
  • Full Sequencing
  • Viral genome sequencing
  • Mitochondrial DNA sequencing
  • Bisulfite sequencing
  • Fragment Analysis
  • Cell line authentication
  • 세균 (Bacteria) 및 진균 (Fungi/Yeast)의 특정 염기서열 분석으로 균주를 동정해드리는 서비스입니다.

Sample Type

    • - 비병원성 균주 : cell (plate or tube) 또는 genomic DNA
    • - 병원성 균주 : 사멸화 균체 또는 genomic DNA

세균동정 (Bacteria)

진균동정 (Fungi/Yeast)

Unknown

    • - 미생물에 대한 기본정보(세균류 또는 진균류)가 없는 경우에 해당합니다.
    • - 여러 종류의 primer set을 이용하여 PCR을 진행하며, 이를 이용한 염기서열을 제공해드립니다.
    • - 분석 부위 : 16s, 5.8s, 18s, 25~28s(D1/D2 domain)

미생물동정 가격표

  • Service type 가격 비고
    16s rRNA sequencing,
    ITS(5.8s, 기존 18s)sequencing
    2rxn ₩17,000 보내주시는 샘플의 상태에 따라
    전처리비용이 추가 될 수 있습니다.
    1rxn ₩11,000
    23s rRNA sequencing ₩30,000
    18s rRNA sequencing ₩17,000
    26s rRNA sequencing ₩17,000
    Unknown ₩30,000
    align ₩1,000
  • Sequencing primer 합성 서비스와 연계한 primer walking 법으로 수 kbp에서 수십 kbp 정제된 DNA 전체 서열을 분석해 드리는 서비스입니다.
    • - 제공된 정보에 따라 sequencing primer를 합성하고, primer walking방식으로 진행됩니다.
    • - Primer walking은 600~700 bp를 기본단위로 진행되고, 디자인 및 sequencing에 통상 2~3일이 소요됩니다.
    • - Full sequencing 전체 소요시간은 제공해주시는 정보에 따라 달라지며, 자세한 내용은 상담을 통해 진행됩니다.

결과 보고

    • - 합성된 Primer 잔량
    • - Sequencing raw data (ab1, seq)
    • - Contig sequence file (sequencing strategy overview, alignment file, assembled single sequence file)

서비스 개요

    • Fragment analysis는 형광이 표지된 primer로 증폭된 PCR product를 Applied Biosystems사의 3130xl genetic analyzer 또는 3730xl DNA analyzer를 사용한 capillary electrophoresis로 DNA fragment size를 오차범위 1~3 bp내로 정확히 분석해 드리는 서비스입니다. 본 분석법은 다양한 생물자원종의 genotyping, DNA profiling, mutation detection 등 그 활용분야가 매우 다양한 분석 서비스로서, 코스모진텍에서는 전문화된 분석 노하우를 바탕으로 빠르고 정확한 서비스를 제공합니다.

서비스 내용

    • - Microsatellite or Short Tandem Repeats (STRs)
    • - Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP) Analysis
    • - Loss of Heterozygosity (LOH)
    • - PCR optimization for fragment analysis
    • - Easy-to-understand report

서비스 활용

    • - Genetic marker development
    • - 유전적 다양성에 대한 연구
    • - 유전 자원의 보존 및 관리
    • - Forensic science
    • - Mutation (ins/del) detection

Workflow

서비스 개요

    • 코스모진텍 세포주검증 (Cell line authentication) 서비스는 게놈상의 STR (short tandem repeat) 마커 profiling을 통하여 다양한 인간유래세포주의 확인, 비교 및 근연관계를 확인할 목적으로 제공되는 서비스입니다. STR profiling을 통한 세포주검증은 고전적인 형태학적 (morphological) 분석이나 핵형 (karyotype) 분석보다도 빠르고 정확한 결과를 보장합니다. 따라서, 본 서비스를 통하여 미리 세포주를 확인하면 실험실에서나 생산시스템에서 세포주가 바뀌거나 섞여서 나올 수 있는 중대한 오류를 미연에 방지할 수 있습니다. 더욱이 연구윤리를 강조하는 최근 과학계의 조류에 따라 논문투고 시 일부 저널들에서 세포주검증 결과를 요구하는 경우가 점차 확대되고 있는 추세로, 본 서비스는 논문의 신뢰도를 높이는데 큰 도움이 될 것으로 기대합니다.
    • 당사에서는 microsatellite 분석 서비스를 통해 축적된 노하우로 빠르고 정확한 세포주검증 결과를 제공하고 있습니다. 본 서비스에서는 2011년 미국 National DNA Index System (NDIS)에서 법의학 목적의 인간 DNA database 구축에 공식 승인 받은 Promega사의 Powerplex 18D kit 를 기본 사용하고, ANSI 표준 (ASN-0002, Authentication of human cell lines: Standardization of STR profiling)에 따라 서비스를 제공합니다. 결과는 Powerplex 18D kit에 구성된 17종의 상염색체 (autosomal) 마커와 1종의 성감별 (gender) 마커 분석 결과를 ATCC 등의 세포주 profile database 와 비교하거나 또는 연구자로부터 직접 제공받은 reference 세포주와 비교하여 일치 여부를 판단해 드립니다.

서비스 내용

    • - Cell genotyping 및 identification
    • - Easy-to-understand report 제공
    • - Cell classification against the?ATCC STR database

활용 분야

    • - Cell line 확인 및 동정
    • - Cell line간의 교차 오염 검증
    • - Cell bank 유지에 필요한 quality control
    • - Cell line 간의 연관성 분석 등
    • - Passage interval간 identity 유지 분석

서비스 특징

    • - 최적화된 분석장비 보유
      : ABI 3130xL genetic analyzers and Genemapper software
    • - 최적의 분석 Solution setup
      : 관련분야 최고의 분석력과 공신력을 제공하는 PROMEGA사의 Powerplex 18D system
    • - 신속한 분석 및 Reporting
      : 샘플 수령 후 3-5일 (영업일 기준)내 분석 완료 및 결과 보고서 제공
      (Express service 기준)
      : 샘플 수거, gDNA extraction 및 PCR반응 및 결과 분석까지 연구자의 편의를 위한 서비스 제공

Cell line authentication 필수 요구 저널 리스트 (2014년 기준)

    • - BioTechniques
    • - AACR Journals
      • -   Cancer Discovery
        -   Cancer Research
        -   Cancer Prevention Research
        -   Clinical Cancer Research
        -   Cancer Epidemiology, Biomarkers & Prevention
        -   Molecular Cancer Therapeutics
        -   Molecular Cancer Research
    • - Cell Biochemistry and Biophysics
    • - International Journal of Cancer
    • - In Vitro Cellular & Developmental Biology ? Animal
    • - Nature

Workflow

  • 특정 유전자의 CpG island에서의 methylation 빈도를 효과적으로 분석해드리는 서비스입니다.

서비스 내용

    • - 특정 염기서열의 methylation 유무를 bisulfite conversion, PCR, TA-cloning & sequencing을 통하여 분석해드립니다.
    • - 특정 부위에서 Methylation 정도는 다수 TA-clone sequencing 결과를 토대로 그 빈도로 평가됩니다.

서비스 개요

    • Mitochondrial DNA sequence 분석은 생물종분류, 계통분류, DNA 고고학, 법의학 및 유전질환 등의 다양한 연구에 활용될 수 있습니다. 코스모진텍은 인간을 포함한 다양한 종의 mitochonrial DNA를 long PCR & primer walking 방법으로 서열정보를 분석하여 드립니다.

서비스 내용

    • - Full mtDNA sequencing
    • - Partial mtDNA sequencing (e.g. COI, ND, or hv region)
    • - Genotyping service by sequencing
    • - Easy-to-understand report 제공

서비스 개요

    • Viral genome 분석 서비스는 overlapping fragment amplification & direct sanger sequencing 방식으로 진행됩니다. 대부분의 바이러스는 변이가 심하기 때문에 일차적으로 genbank에 등록되어 있는 reference genome 염기서열을 분석한 후 degenerative primer를 디자인합니다. 디자인된 primer는 cDNA 합성 (RNA 바이러스) 및 partial overlap fragment (1~1.3 kb) 증폭에 사용되고, 증폭된 DNA를 sequencing한 후 최종적으로 genome 전체서열로 assembly합니다.

서비스 내용

    • - Viral DNA/RNA extraction (nonpathogenic only)
    • - Degenerative primer design
    • - Full or targeted sequencing
    • - End sequencing (5'RACE or 3'RACE)
    • - Genome ORF annotation
    • - Phylogenetic analysis
    • - Easy-to-understand report 제공

활용 분야

    • - Virus identification and classification
    • - Virus mutation detection
    • - Viral genome characterization

Workflow

서비스 가격

  • Normal sequencing ₩7,500
    Difficult sequencing ₩15,000
    Full sequencing ₩60,000/kb
    BigDye pre-reacted running ₩4,000
    Plasmid miniprep ₩3,000
    PCR purification ₩3,000
    Gel extraction ₩3,000
    Custom PCR ₩3,000

대량 샘플에 대한 견적은 담당 영업사원에게 문의 바랍니다.

Universal Primer list

Vector primer

  • Primer Sequence Primer Sequence
    T7 TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG MATCHMAKER5 GAA GAT ACC CCA CCA AAC
    T7terminator GCT AGT TAT TGC TCA GCG G MATCHMAKER3 GTG AAC TTG CGG GGT TTT TCA GTA TCT ACG AT
    T3 CAA TTA ACC CTC ACT AAA GAL4(-BD)-3 TTT TCG TTT TAA AAC CTA AGA GT
    SP6 ATT TAG GTG ACA CTA TAG GAL4(-BD)-5 TCA TCG GAA GAG AGT AGT
    BGH-R CTA GAA GGC ACA GTC GAG GC pJET1.2-F CGA CTC ACT ATA GGG AGA GCG GC
    M13F(-40) GTT TTC CCA GTC ACG AC pJET1.2-R AAG AAC ATC GAT TTT CCA TGG CAG
    M13R(-40) CAG GAA ACA GCT ATG AC pET-upstream ATG CGT CCG GCG TAG AGG
    M13F(-20) GTA AAA CGA CGG CCA GT DuetUP2 TTG TAC ACG GCC GCA TAA TC
    M13R(-20) GCG GAT AAC AAT TTC ACA CAG DuetDown1 GAT TAT GCG GCC GTG TAC AA
    pGEX5 GGG CTG GCA AGC CAC GTT TGG TG ACYCDuetUP1 GGA TCT CGA CGC TCT CCC T
    pGEX3 CCG GGA GCT GCA TGT GTC AGA GG pFB-F GGA TTA TTC ATA CCG TCC CA
    CMV-F CGC AAA TGG GCG GTA GGC GTG pFB-R CAA ATG TGG TAT GGC TGA TT
    CMV30 AAT GTC GTA ATA ACC CCG CCC CGT TGA CGC pMAL-F AAC ATC CCG CAG ATG TCC
    CMV24 TAT TAG GAC AAG GCT GGT GGG CAC pMAL-R CAA GCT GCC ATT CGC CAT
    EGFP-C CAT GGT CCT GCT GGA GTT CGT G pBad-F ATG CCA TAG CAT TTT TAT CC
    EGFP-N CGT CGC CGT CCA GCT CGA CCA G pBad-R GAT TTA ATC TGT ATC AGG
    SV40 pAR GAA ATT TGT GAT GCT ATT GC pQE-forward CCC GAA AAG TGC CAC CTG
    RV3 CTA GCA AAA TAG GCT GTC CC pQE-reverse GTT CTG AGG TCA TTA CTG G
    RV4 GAC GAT AGT CAT GCC CCG CG U6(FLAP) CAG TGC AGG GGA AAG AAT AGT AGA C
    GL1 TGT ATC TTA TGG TAC TGT AAC TG U6pro GGG CAG GAA GAG GGC CTA T
    GL2 CTT TAT GTT TTT GGC GTC TTC CA EBV-R GTG GTT TGT CCA AAC TCA TC
    mCherry-N GTG GCC GTT CAC GGA GCC IRES-F CTG AAG GAT GCC CAG AAG
    mCherry-C CGC CTA CAA CGT CAA CAT CA IRES-R GAC GGC AAT ATG GTG GAA

Microbial Identification primer

    • Bacteria
    • Fungi / Yeast
  • Target region Primer Sequence
    16s rRNA 27F AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG
    337F GAC TCC TAC GGG AGG CWG CAG
    518F CCA GCA GCC GCG GTA ATA CG
    785F GGA TTA GAT ACC CTG GTA
    1100F YAA CGA GCG CAA CCC
    518R ATT ACC GCG GCT GCT GG
    800R TAC CAG GGT ATC TAA TCC
    926R CCG TCA ATT CMT TTR AGT TT
    1100R GGG TTG CGC TCG TTG
    1392R ACG GGC GGT GTG TRC
    1492R GGT TAC CTT GTT ACG ACT TC
    23s rRNA 1f TCC GAA TGG GGA AAC CC
    16r GGA ACT TAC CCG ACA AGG
    9f AAG AGG GAA ACA RCC CAG A
    23r TTC GTG CTT AGA TGC YTT CA
  • Target region Primer Sequence
    5.8s rRNA(ITS) ITS1 TCC GTA GGT GAA CCT GCG G
    ITS4 TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC
    18s rRNA NS1 GTA GTC ATA TGC TTG TCT C
    NS8 TCC GCA GGT TCA CCT AC GGA
    25~28s rRNA
    (D1/D2 domain)
    NL1 GCA TAT CAA TAA GCG GAG GAA AAG
    NL4 GGT CCG TGT TTC AAG ACG G
    25~28s rRNA
    (D1/D2/D3 domain)
    LROR ACC CGC TGA ACT TAA GC
    LR7 TAC TAC CAC CAA GAT CT
  • 5' end of mCherry, reverse primer
  • 3' end of mCherry, forward primer
  • 3' end of IRES, forward primer
  • 5' end of IRES, reverse primer
  • SV40 polyA terminator, reverse primer
  • 5' end of EGFP, reverse primer
  • 3' end of EGFP, forward primer

Vector-Binding Primer

  • Vector Forward primer Reverse primer Manufacturer
    pGEM-T easy T7, M13F(-40), M13F(-20) SP6, M13R(-40), M13R(-20) Promega
    pMD20 M13F(-40), M13F(-20) SP6, M13R(-40), M13R(-20) Takara
    pCR2.1-TOPO M13R(-40) T7, M13F(-20), M13F(-40) Invitrogen
    pENTR M13F(-40), M13F(-20) T7, M13R(-40) Invitrogen
    pUC series M13F(-40), M13F(-20) M13R(-40), M13R(-20) -
    pBluescript series T7, M13F(-40), M13F(-20) M13R(-40), M13R(-20) Agilent
    pcDNA3 / pcDNA3.1 CMV-F, T7 BGH-R Invitrogen
    pCMV6-Entry CMV-F, T7 CMV24, M13R(-40) Origene
    pEGFP-N series CMV-F EGFP-N Invitrogen
    pEGFP-C series EGFP-C SV40 pAR Invitrogen
    p3XFlag series CMV 30 CMV 24 Sigma
    pET series T7 T7terminator Novagen
    pGEX series pGEX5 pGEX3 GE healthcare
    pQE series pQE-F pQE-R Qiagen
    pGL series RV3 GL2 Promega
    pGADT7 matchmaker5 matchmaker3 clontech
    pGBKT7 GAL4(-BD)-5 GAL4(-BD)-3 clontech
    pFastBac pFB-F pFB-R Invitrogen
    pET Duet (MCS1) pET-upstream Duetdown1 -
    pET Duet (MCS2) Duetup2 T7terminator -
    pACYC Duet (MCS1) pACYCup1 Duetdown1 -
    pACYC Duet (MCS2) Duetup2 T7terminator -

Troubleshooting

Failed DNA sequencing reaction

    • 원인
    • - Bad DNA quality
    • - Wrong primer
    • 해결방안
    • - Template DNA를 cleanup해서 사용
    • - Template DNA에 primer site가 있는지 확인

Noisy or weak DNA sequencing traces

    • 원인
    • - 너무 높거나 낮은 DNA 농도
    • - Primer 농도가 너무 낮거나 degradation되었을 때
    • 해결방안
    • - Agarose gel 전기영동 및 spectrophotometer 농도 측정으로 적정 농도 template사용
    • - 적정 농도 primer를 사용하거나, primer의 반복적인 동결 및 해동을 피할것

Mixed signal in the trace

    • 원인
    • - 같은 primer site를 가진 둘 이상의 template가 섞여 있을 경우
    • - 한 template내에 같은 primer site가 두군데 이상일 경우
    • 해결방안
    • - DNA template를 agarose gel에서 단일 샘플인지 확인
    • - template 염기서열 확인해 보거나, 다른 primer로 sequencing

Sudden ending of DNA sequence signal

    • 원인
    • - DNA template내에 매우 안정적인 secondary structure
    • - 긴 G 또는 C stretch
    • 해결방안
    • - 역방향 primer로 sequencing
    • - Difficult sequencing 서비스로 진행

Slippage sequencing

    • 원인
    • - 반복서열 또는 homopolymeric sequence
    • - insertion 또는 deletion sequence가 있는 대립유전자
    • 해결방안
    • - 역방향 primer로 sequencing
    • - 각 대립유전자에 특이적인 primer로 각각 sequencing

Blurry trace chromatogram peaks

    • 원인
    • - Capillary overload
    • - High sequencing run voltages
    • 해결방안
    • - 적정량 및 적정조건으로 rerunning

Sharp peaks in the trace signal

    • 원인
    • - Capillary안에 작은 gas bubble
    • 해결방안
    • - Buffer를 심하게 흔들지 말고, 필요시 degassing한 후 rerunning

TEST1

  • TEST1TEST1TEST1TEST1TEST1TEST1TEST1TEST1TEST1
    • - 샘플 접수 후 24시간 이내 결과 발송 및 SMS서비스
    • - Sequencing Primer 합성 서비스와 연계되어 배송시간 단축
    • - 길고 정확한 결과 제공 (capillary length : 50cm)
    • - 자사 제품을 이용한 다양한 부가 서비스 제공

TEST2

  • TEST2TEST2TEST2TEST2TEST2TEST2TEST2TEST2TEST2TEST2TEST2TEST2
    • - 샘플 접수 후 24시간 이내 결과 발송 및 SMS서비스
    • - Sequencing Primer 합성 서비스와 연계되어 배송시간 단축
    • - 길고 정확한 결과 제공 (capillary length : 50cm)
    • - 자사 제품을 이용한 다양한 부가 서비스 제공
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