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  • 기본적으로 모든 주문건에 대해서 Polyacrylamide gel electrophoresis로 품질관리를 실시하고 있습니다.
    50 mer 이하의 제품에 대해서는 MALDI-TOF/MS에 의한 질량 분석을 실시하고 있습니다.
  • Oligonucleotide는 일반적으로 건조된 상태로 공급됩니다. 이것은 운송과정에서 노출될 수 있는 여러가지 환경적 요인으로 인한 oligo의 변성을 방지하기 위함입니다. 건조된 oligo는 때때로 용기 개봉 과정에서 손실될 수 있으니 잠시 원심분리한 후 개봉하시기 바랍니다. 특히 latex 장갑 등 정전기를 일으키는 착용물을 끼고 뚜껑을 개봉하면 건조된 oligo powder가 손실될 위험성이 높으니 특히 주의를 요합니다. Oligo 제품을 수령하신 후 용기에 기재된 양의 TE buffer (10 mM Tri-HCl pH8.0, 1 mM EDTA) 또는 멸균증류수에 녹여 100 uM stock 상태로 -20℃이하에 보관하시고, 사용시 적정 농도로 희석하여 사용하시기를 권장합니다. 수용액 상태에서 oligo는 멸균증류수보다 TE buffer가 안정하기는 하나 경우에 따라서 TE buffer 조성이 반응에 영향을 미칠 수 있으니 주의바랍니다. 수용액 상태의 Oligo를 반복적으로 동결/해동할 경우 변성될 위험성이 있으니 소량 분주하여 사용하시기를 권장합니다.
  • 당사에서는 99 mer까지를 합성 한계로 정하고 있습니다. 그 이상의 길이를 의뢰하실 경우는 당사에 문의해 주시기 바랍니다.
  • Oligo 합성에 사용되는 Column내 CPG (controlled pore glass)의 양에 따라 합성되는 oligo의 합성수율은 달라집니다. 예를 들어 0.05 umole 스케일로 주문 하실 경우, 3'base가 최소 0.05 umole 이상 coupling 될 수 있는 양의 CPG가 충진된 column을 사용합니다. 이후 합성과정에서 매 cycle 다음 염기가 coupling 되지 못한 0~2%를 배제시키는 capping 과정에서 손실이 발생하고, 그 다음 정제공정상에서도 손실이 발생합니다. 따라서 0.05 unmole 스케일이란 합성 시 시작량을 의미하기 때문에 최종 양과 차이가 있을 수 있습니다. 또한 0.2 umole 스케일 주문시 0.05 umole 스케일로 주문하셨을 때와 최종 양이 반드시 비례 증가되진 않습니다.
  • Oligo size, coupling efficiency, base composition, 정제방법 등으로 인해 합성 수율은 달라집니다.
  • 동일한 oligo를 합성한다해도 합성과정과 정제과정에서의 여러 가지 요인들로 인해 oligo의 합성 수율은 차이가 나게 됩니다.
  • Oligo의 50%가 그 상보서열에 결합해 있을 때의 온도를 의미하며, 이는 절대값이 아니고 농도 및 수용액상의 salt 농도 등에 따라 달라집니다.
  • Tm 값의 계산식은 여러 가지 종류가 있어 채용하는 계산식에 따라 값이 다릅니다. 간혹 고객님께서 사용하시는 계산식 program에 따라 당사의 계산과 다른 결과가 나오기도 합니다. 당사에서 사용하는 Tm calculator는 일반적으로 염기 개수에 일정 값을 곱하는 단순 계산식이 아닌, 염기 조성뿐만아니라 배열 순서에 따라 Tm 값이 달라지는 점을 고려하여 다음 계산식을 채택하고 있습니다. Tm 값은 이론적으로 계산된 값이기 때문에 실제 실험결과와 일치하지는 않습니다. 따라서 PCR 등에 oligo 사용시 실험적으로 최적 온도 적정이 필요합니다.
    * 17 mer 이하 :

    4×(G+C+R/2+Y/2+M/2+S+K/2+D/3+H/3+2B/3+2V/3+N/2)+2×
    (A+T+R/2+Y/2+M/2+W+K/2+2D/3+2H/3+B/3+V/3+N/2+I+U)

    * 18 mer 이상 :

    60.8+41×{(G+C+R/2+Y/2+M/2+S+K/2+D/3+H/3+2B/3+2V/3+N/2)/염기수}-(500/염기수)

    * Salt 농도 조건

    0.0567(M)=0.05(KCl 농도)+0.01×0.67(Tris 농도)

    50 mM KCl농도

    10 mM Tris-HCl 농도(pH8.4-9.0 at 25℃)
  • OPC (Oligonucleotide Purification Cartridge) 정제는 간이 컬럼 정제라고도 하며, 역상크로마토그래피 (reverse-phase chromatography) resin, Oligo R3가 충진된 column을 사용합니다. 합성이 끝난 Oligo는 정상적인 합성이 완료된 것과 coupling을 이루지 못해 capping된 불완전 산물이 혼합되어 있습니다.
    합성 마지막 단계에서 DMT기가 결합된 정상적으로 합성이 완료된 oligo는 DMT기의 소수성으로 OPC resin에 결합하게 되고 나머지 불완전한 산물 및 부산물들은 column을 통과해서 빠져나갑니다. 그 다음 oligo에서 DMT기를 떼어내는 과정을 통하여 resin으로부터 oligo를 회수하게 됩니다.
  • 50 mer 이상의 긴 oligo 합성시 고순도 oligo를 필요로 할 때 PAGE정제를 시행합니다. OPC 정제 산물을 PAGE (Polyacrylamide Gel Electrophoresis)로 전개하여 주밴드만 분리하는 정제법으로 90% 이상의 고순도 oligo를 확보할 수 있습니다. 정제 과정에서 손실이 많아 최종 수득량이 다소 적을 수 있습니다.
  • 50 mer 이하의 oligo 합성시 고순도 oligo를 필요로 할 때 RP-HPLC (Reverse-phase HPLC) 정제를 시행합니다. 기본 원리는 OPC와 유사하나, HPLC column을 사용하기 때문에 높은 분리능으로 90% 이상의 고순도 oligo를 확보할 수 있습니다. 특히 형광이 표지된 oligo 합성시 반드시 필요한 정제 공정입니다. 정제 과정상의 손실로 최종 수득량이 다소 적을 수 있습니다.
  • Oligo 합성 과정에서는 매 cycle당 약 0~2%는 coupling반응이 일어나지 않아 capping으로 제거됩니다. 따라서, oligo 길이가 길어지면 그만큼 합성 실패 percentage가 증가하게 됩니다. 99% 효율일 때 정상의 oligo와 잘못된 oligo의 혼합비율은 아래표와 같습니다.
    Percentage Yield of Full-length and Failed Oligo by Length
    Length(no. of bases) Product Failure
    10 91 9
    20 83 17
    50 61 39
    75 48 52
    100 37 63
    참고로 표에서는 전체 합성효율에 영향을 미칠 수 있는 다른 화학적 요소를 배제한 것으로, 대표적으로 purine계 염기 (특히 'A')에서 base가 떨어져 나가는 "depurination" 현상입니다.
    Depurination된 염기는 deprotection 단계에서 보통 제거되며 이를 "X elimination" 이라 합니다. Depurination의 비율은 매우 낮으나 올리고 길이에 따라 크게 늘어납니다.
  • G가 4개이상 반복되면 guanine tetraplex 형태로 aggregation 될 수 있기 때문에 합성에 어려움이 있습니다. 당사에서는 오랜 합성 경험을 통해 얻은 기술로 연속 G가 포함된 oligo도 큰 어려움 없이 합성해 오고 있습니다. G가 반복되는 oligo 합성시 PAGE 및 HPLC가 어려운 문제가 있기 때문에 OPC 정제를 권장합니다.

출처: http://www.polyplus-transfection.com/technical-resources/faq/

  • Clone이 제작되면, GeneCopoeia는 PCR을 이용한 size 분석, ORF full sequencing, Restriction Enzyme 처리를 통한 plasmid clone의 정확성 여부를 확인하는 엄격한 품질관리 절차를 거쳐 정확한 clone을 고객에게 제공합니다.
  • 불가능합니다.
  • 시퀀스의 차이는 아래와 같은 두 가지의 잠재적인 요인에 의해 발생할 수 있습니다.
    • 1) 자연적으로 발생할 수 있는 polymorphisms, alternative splicing, annotation 업데이트에 기인한 동일한 유전자의 version 및 copy의 불일치, Sequencing 에러 및 분석 오류
    • 2) PCR cloning 과정에서 발생할 수 있는 시퀀스 오류
    매우 자주 GeneCopoeia clone의 잠재적인 사용자들은 단지 1개의 reference transcript의 시퀀스와 당사의 sequencing data를 비교하며, 시퀀스의 차이가 PCR에 의해 발생할 수 있는 mutation에 의한 것이라고 생각하는 경향이 있습니다. 20,000개에 가까운 human gene의 multiple clone들의 분석을 통해 당사의 시퀀스 data와 해당 gene의 모든 transcripts 및 genomic sequence, ESTs, 기타 cDNA/mRNA transcripts를 포함하는 시퀀스와 비교했을 때 위의 항목 1번에 해당하는 자연발생적 원인에 의한 것이 거의 대부분임을 확인하였습니다. 평균적으로 public domain gene transcripts와 해당 gene의 genomic sequence의 편차보다 당사의 ORF clone과 해당 gene의 genomic sequence의 편차가 더 적음을 확인하였습니다. 우리는 PCR cloning 과정에서의 mutation 발생 가능성을 완전히 제거하였다고 확신할 수는 없지만, 이러한 경우는 상당히 드문 경우라고 믿고 있습니다. 원하는 sequence로의 보정을 위해 당사는 non-PCR 기반의 mutagenesis kit을 이용하여 nucleotide 변환을 진행할 것을 제안합니다. (유료서비스)
  • 자연적으로 발생할 수 있는 protein-coding sequence와 NCBI reference sequence간의 차이로 인해, 당사는 OmicsLink™ ORF clone sequence와 NCBI reference sequence의 100% 일치를 보장하지 않습니다. 당사는 OmicsLink™ ORF expression clone sequence가 point mutation에 의해 non-stop codon이 stop codon으로 변환되어 발생할 수 있는 translation termination mutation 및 deletion, insertion등 인위적인 frame-shift에 의해 발생하는 변이가 없음을 보장합니다. 이러한 당사의 정책이 PCR에 의해서는 거의 일어나지 않는 자연적으로 발생할 수 있는 polymorphisms 및 mutation을 보장하는 것은 아닙니다. 만일 다른 cDNA library로부터 특정한 version의 gene ORF clone을 원하는 경우, 당사는 특정 version의 clone 제작을 위해 최선의 노력을 다하겠지만, 성공을 보장할 수는 없습니다.
  • pReceiver-B01 및 pReceiver-WG02/WG03/WG04/WG05/WG09/WG16의 모든 expression clones은 E. coli에서 expression test 또는 Roche사의 cell free protein production system을 이용하여 테스트 하였습니다. 이외의 다른 특성의 clone 및 다른 host cell system에 대한 expression clone들은 단백질 발현 테스트가 진행되지 않았습니다.
  • Knockdown 효율은 transfection 효율이 80% 이상일 경우 측정해야 합니다. Transfection 효율은 Vector 내의 reporter gene의 발현으로 확인할 수 있습니다. Transfection한 cell로부터 확보한 RNA를 사용하여 quantitative RT-PCR(qPCR)로 유전자 발현량의 감소 수준을 측정할 수 있습니다. 그러나 shRNA construct에 의한 silencing 효율을 측정하는 데에는 RT-qPCR 보다는 Western Blot을 추천하며, 유전자 발현량은 반드시 scrambled control clone 과 shRNA clone을 각각 transfection한 cell을 비교하여 확인해야 합니다.
  • GeneCopoeia는 발현 cassettes안의 shRNA 서열이 target 유전자와 동일함을 보장합니다. 만약 4개 construct 중 그 어떤 것도 qRT-PCR 상에서 70% 이상의 knockdown 효율을 보여주지 않으며 이러한 knockdown 효율이 construct가 원인이라고 판단되는 경우, specific 유전자를 targeting하는 새로운 4개 clone을 무료로 제공해드립니다. 이를 위해 고객은 control clone과 함께 확인한 quantitative RT-PCR(qPCR), 혹은 Western blot 실험에 대한 결과를 제공하여야 합니다.
  • TALE과 CRISPR은 genome editing을 시작하기 위해서 특이적으로 디자인된 target sequence를 인식합니다. 두 시스템의 가장 큰 차이점은 target sequence를 인식하는 방식입니다.
    CRISPR은 20 nucleotide target sequence와 동일한 single guide RNA (sgRNA)를 사용합니다. Target sequence는 Protospacer Adjacent Motif (PAM)으로 알려진 3 nucleotide (5’-NGG-3’) 바로 뒤에 존재해야 하며, sgRNA는 원하는 site로 Cas9 nuclease를 guide하게 됩니다. CRISPR system을 사용할 경우에는 sgRNA sequence를 디자인해야 합니다. Figure Mechanism of CRISPR-Cas9:sgRNA target recognition and cleavage

    TALE은 연속적으로 이어진 34개의 amino acids로 구성된 repeats 내의 variable amino acid를 사용하여 target sequence를 인식할 수 있는 단백질입니다. 이러한 variant amino acids를 Repeat Variable Diresidues (RVDs)라고 합니다. 각각의 repeat는 1 RVD를 포함하며 각각의 RVDs는 1개의 특이적 nucleotide (A, T, G, C)를 인식할 수 있습니다.
    Figure Top : Schematic representation of a TAL effector. Bottom : Typically-used RVD recognition code

    TALE은 nuclease 또는 transcriptional modulator 등의 genome editing motifs와 fusion되어 있습니다. TALE 기반의 system을 사용할 경우에는 target sequence를 정확히 인식할 수 있는 순서로 RVDs를 조립해야 합니다.
    GeneCopoeia의 TALEN과 CRISPR sgRNA는 기본적으로 coding region의 앞쪽 부분을 targeting하여 해당 유전자로부터 파생될 수 있는 이미 알려진 또는 예측되는 transcript variants들을 모두 Knock-out 할 수 있도록 디자인 됩니다.
  • TALEN과 CRISPR 시스템은 각기 장단점이 존재하며, 어느 system을 사용하는지의 선택은 실험자가 달성하고자 하는 연구목적에 달려 있습니다.
    CRISPR은 TALEN보다 Gene을 editing하는 효율이 더 높습니다. 또한 DNA methylation 여부와 상관없이 작동하며, multiplex 실험이 훨씬 더 용이합니다. 이러한 부분을 TALEN에 비해 CRISPR이 가지고 있는 장점이라고 할 수 있습니다.
    반면, Cas9 nickase를 포함하는 CRISPR의 경우는 TALEN에 비해 off-target site를 modification하는 성향이 더 강하므로, 연구자의 실험 목적 및 실험 적용에의 영향 여부에 따라 문제가 될 수도 있습니다.
  • 만약 단순히 human 또는 mouse 유전자 knockout을 하고자 할 경우, 연구자는 GeneCopoeia website에서 TALEN/CRISPR 검색 page에서 원하는 유전자를 찾고, 연구자의 system에서 작동할 수 있는 적합한 clone을 선별하여, GeneCopoeia 국내 대리점인 코스모진텍을 통해 견적 및 주문을 할 수 있습니다. 또한 검색 결과 page에서 knock-out에 사용할 수 있는 donor clones도 함께 주문할 수 있습니다. 만약 point mutation 등의 다른 application으로 실험해야 한다면, GeneCopoeia에 해당 내용을 요청하여 별도의 견적서를 받을 수 있습니다.
  • GeneCopoeia™은
    • 1) 40,000 종 이상의 human 및 mouse ORF expression clones, human, mouse, rat 및 다른 동물의 genome-wide target genes에 대한 small hairpin RNAi (shRNA), 알려진 모든 human, mouse, rat miRNA에 대한 miRNA inhibitor clones
    • 2) 20,000 종 이상의 human promoter reporter clones 및 18,000 종 이상의 mouse promoter reporter clones
    • 3) Human 및 mouse의 CRISPR sgRNA clones 등
    방대한 수의 HIV 유래 및 FIV 유래 lentivirus 시스템을 사용한 clone을 제공합니다. 이 시스템은 우수한 발현 레벨과 실제 거의 모든 mammalian cell type에 대해 높은 유전자 전달 효율을 제공합니다.
    Lentiviral expression construct는 full-length sequencing, restriction enzyme digestion 및 gene-specific과 vector-specific primer을 사용한 PCR-size validation 을 통해 검증됩니다. GeneCopoeia™ EndoFectin Lenti Reagent (Cat No. EFL1001-01), TiterBoost reagent, 293Ta lentiviral packaging cell line (Cat No. CLv-PK-01) 와 mycoplasma detection kit을 함께 사용했을 경우, GeneCopoeia™ lentiviral product는 높은 viral titer를 얻을 수 있으며, bacteria, fungi 및 common mycoplasma의 오염이 없음을 확인할 수 있습니다.
  • Lentivirus는 세포 독성을 가지고 있습니다. 필요 이상으로 많은 양의 lentivirus를 첨가할 경우 또는 infection 시간을 지나치게 오래 유지할 경우 연구자의 중요한 세포에 손상을 야기할 수 있습니다. 이러한 경우에는 multiplicity of infection (MOI)를 낮은 수준으로 조정해야 합니다. 우리는 transduction후 4~8시간 경과후에 culture media를 새로운 complete media로 교체할 것을 권장합니다 (transduction 후 12시간을 넘기지 않음).
  • 10개의 사람 조직 total RNA 시료에서 얻어진 reverse transcript products인 cDNA pool이 검증을 위한 template로 사용됩니다. qPCR은 0.2 μM primer와 GeneCopoeia All-in-One™ qPCR Mix를 사용하여 수행됩니다. GeneCopoeia All-in-One™ qPCR pimers (또는 GeneCopoeia All-in-One™ miRNAqPCR primers)는 targeted gene과 miRNA에 대해 정확한 size의 단일 amplicon 생성 및 single dissociation curve peak 생성 여부 확인을 통해 검증됩니다.
  • 실험 과정은 크게 두 가지 과정으로 나눌 수 있습니다.
    첫번째 과정은 polyA polymerase를 사용하여 miRNA의 3’ 말단에 PolyA tail을 붙이는 것이며, 동시에 oligo(dT) primer와 MMLV reverse transcriptase를 사용하여 miRNA를 polyA tail 위치로부터 reverse transcription합니다.
    두번째 과정에서 miRNA 특이적인 forward primer와 Universal Adapter primer를 PCR primer pair로 SYBR® Green이 포함된 qPCR master mix과 함께 Real Time PCR 을 수행하여 reverse transcribed miRNA를 특이적으로 검출하게 됩니다. Figure 1. Experimental design used by the GeneCopoeia All-in-One™ miRNAqRT-PCR Detection Kit
  • GeneCopoeia All-in-One™ miRNA primers와 함께 사용했을 경우, GeneCopoeia All-in-One™ miRNAqRT-PCR Detection Kit은 최소 20 pg의 total RNA 또는 10 pg의 small RNA에서 miRNA를 검출할 수 있습니다.
  • 이 Array system을 사용하면, primer 설계와 유전자 및 miRNA의 검증에 드는 시간이 획기적으로 감소합니다. 또한 유전자 또는 miRNA의 실험 batch 당 qPCR 검출이 동시에 96-well 또는 384-well plate에서 가능합니다.
    이것으로 실험의 단순화와 실험 속도 증가가 가능하게 됩니다.
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    • (주)코스모진텍
    • 대표이사 : 이영준
    • 사업자등록번호 : 209-81-25456
    • 본사 서울특별시 성동구 성수이로 10길 14 (성수동2가, 에이스 하이엔드 성수타워) 304~311호
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